A continuación, la fructosa-1,6-bisfosfato es dividida por la enzima aldolasa en dos moléculas de tres carbonos: gliceraldehído-3-fosfato y dihidroxiacetona fosfato. Esta última es convertida también en gliceraldehído-3-fosfato, de modo que ambas ramas continúan por una misma secuencia de reacciones. En esta segunda fase ocurre la producción de NADH, una molécula transportadora de electrones fundamental para la obtención posterior de energía. La oxidación del gliceraldehído-3-fosfato genera compuestos fosforilados de alta energía que permiten la síntesis de ATP mediante fosforilación a nivel de sustrato. Debido a que cada molécula de glucosa produce dos moléculas de gliceraldehído-3-fosfato, muchas de las reacciones aparecen multiplicadas por dos en el esquema.
La fase final culmina con la formación de dos moléculas de piruvato, acompañadas de una ganancia neta de energía. Aunque se consumen dos ATP al inicio, se producen cuatro ATP en etapas posteriores, resultando en una ganancia neta de dos ATP por molécula de glucosa. Además, se generan dos moléculas de NADH. El diagrama también muestra una ruta alternativa donde el piruvato puede transformarse en lactato mediante la enzima lactato deshidrogenasa, regenerando NAD⁺ y permitiendo que la glucólisis continúe en condiciones de baja disponibilidad de oxígeno.
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