lunes, 28 de noviembre de 2016

7 ESTUDIO DE LA CELULA EUCARIOTA

Bajo el microscopio de luz, el citoplasma de una célula eucariota parece carente de estructura interna, sin embargo incluso antes del comienzo del siglo XX, el examen cuidadoso de secciones pigmentadas de tejidos animales indicaban la existencia de un complejo sistema de estructuras internas. Sin embargo, no fue sino hasta la invención el microscopio electrónico en la década de 1940 que los biólogos comenzaron a apreciar la diversa gama de estructuras rodeadas por membranas que poseían la mayoría de las células eucariotas, e incluso, algunas procariotas.

Los primeros usuarios del microscopio electrónico vieron vesículas de diferentes tamaños, que transportaban materiales de densidad variable, largos canales que radiaban en el citoplasma formando redes como si fueran canales múltiples apretujados entre sí. Poco a poco se hizo evidente que los mecanismos que permiten el funcionamiento celular a nivel bioquímico ocurría de forma especializada en estos compartimentos de la estructura interna de las célula. A medida que más células fueron analizadas comenzaron a observarse patrones entre estas estructuras en diferentes linajes, desde hongos unicelulares a plantas, desde amebas hasta el ser humano.

Debido a que los organelos, sin importar su fuente pueden ser clasificados en tipos más o menos generales, con funciones consistentes, es que estos reciben nombres que son muy famosos, sin embargo podemos subdividir los organelos de la célula en membranosos y no membranosos. Los organelos no membranosos no están rodeados por membranas, y en su lugar están hechos de proteína o ARN, como el citoesqueleto, o los ribosomas. Los organelos membranosos son definidos por las membranas biológicas y en general son los siguientes: retículos cercanos al núcleo; retículos intermedios entre la membrana externa y el núcleo; y vesículas de transporte o almacenamiento. Estos organelos membranosos no son rígidos, se los debe visualizar como un sistema de bombas de jabón dinámico, las vesículas se desprende o fusionan con los retículos más grandes, los cuales pueden crecer o hacerse más pequeños.

Tomados en su conjunto, estos organelos conforman el sistema de membranas internas o endomembranas, en los que las funciones individuales hacen parte de un todo coordinado. Debido a los adelantos en biología evolutiva en la actualidad los organelos energéticos no se clasifican como parte del sistema de membranas internas, pero eso es una verdad a medias. Los organelos energéticos surgieron por endosimbiosis bacteriana, por lo que las membranas mas internas de estos no provienen de la célula eucariota y en efecto no harían parte de sistema de membranas internas, pero la última membrana que rodea a estos como la mitocondria y el cloroplastos proviene evolutivamente de vesículas endocíticas, y por lo tanto si deberían hacer parte del sistema de membranas internas. 

En el presente texto se los mencionará como los organelos energéticos separados formalmente del sistema de membranas internas. Para poder estudiar el sistema de membranas internas se requirió del desarrollo de nuevas tecnologías que fueran más allá de la información que puede proporcionar un microscopio óptico, y algunas de las más importantes fueron las siguientes..

Referencias: (Black & Black, 2012; Karp, 2010, 2013; Sadava et al., 2014, 2008; Solomon et al., 2008; Tortora et al., 2010)

7.1 Microscopio electrónico

El microscopio permite dos cosas fundamentales, la primera es que permite ver la célula, y la segunda es que permite ver las cosas que están en el interior de la célula. En primera instancia, el microscopio incrementa el tamaño aparente de las cosas. Este proceso se denomina magnificación. Sin embargo el solo hecho de magnificar algo no significa que puede verse con claridad.

La segunda capacidad del microscopio es que, al mismo tiempo que permite ver las cosas como si fueran más grandes, también permite ver los detalles de sus formas, a esta propiedad la denominamos resolución. Formalmente, la resolución es la distancia mínima en la que dos objetos pueden alejarse y aun así seguirse viendo como dos cosas independientes. La resolución del ojo humano es del alrededor de 0,2 mm  (200 micrómetros).

La mayoría de las células son más pequeñas que 200 mirometros, y por lo tanto son invisibles al ojo humano. El microscopio magnifica e incrementa la resolución de modo tal que las células y sus estructuras internas pueden ser vistas. Existen dos tecnologías de microscopio diferentes, el microscopio óptico y el microscopio electrónico.

El microscopio electrónico permite una mayor resolución y magnificación, sin embargo debe tenerse en cuenta de que lo que se observa es un preparado especial, que requiere la deshidratación y por lo tanto la muerte celular. Es decir, bajo el microscopio electrónico solo pueden verse células muertas, por lo que los analistas deben tener eso en cuenta a la hora de analizar los resultados. Los microscopios ópticos fueron los primeros en aparecer, y su tecnología aunque limitada para la amplificación y la resolución, permite la observación de células vivas.

Antes de lidiar con los detalles de la estructura celular es útil considerar los muchos usos que posee la microscopia. Una rama completa de la medicina, la patología, hace uso de muchos métodos diferentes de microscopia para ayudar en el análisis de las células en el diagnóstico de las enfermedades. 

Por ejemplo, un cirujano remueve una muestra de tejido para que el patólogo determine si es tumoral o no. Para realizar el esto, el patólogo deberá examinar rápidamente el tejido mediante microscopia de contraste de fase o contraste de interface para determinar el tamaño, la forma y la dispersión de las células.  Usar colorantes específicos para tinturar los tejidos en microscopia óptica para ver algunas características como el núcleo, las características de la división celular o algunos otros organelos que fijan los colorantes de manera densa. También se pueden usar colorantes fluorescentes. Finalmente puede usarse el microscopio electrónico para observar las estructuras internas en detalle como la mitocondria y la cromatina.

Referencias: (Black & Black, 2012; Karp, 2010, 2013; Sadava et al., 2014, 2008; Solomon et al., 2008; Tortora et al., 2010)

7.2 Autoradiografía

De todas las células del cuerpo, las células ancinares poseen un sistema de membranas internas particularmente grande. Estas células se especializan en la síntesis y secreción de las enzimas digestivas. Después de haber sido segregadas por el páncreas, estas enzimas son transportadas a través de varios conductos hasta el intestino delgado, donde se encargan de la digestión química de los alimentos. ¿Dónde al interior de las células ancinares se sintetizan las proteínas, y como es que estas sustancias alcanzan el exterior de la célula sin digerirse esta misma?

Estas preguntas son inherentemente difíciles de responder debido a que todos los pasos para la secreción ocurren de forma simultánea en la célula. Para poder aislar los pasos en un solo ciclo desde el ensamblaje del péptido hasta la maduración de la enzima activa  James Jamieson y George Palade de la universidad de Rockefeller emplearon una técnica denominada autoradiofragía.

La autoradiografía provee los medios necesarios para visualizar los procesos bioquímicos permitiendo al investigador determinar la localización de materiales marcados radioactivamente al interior de una célula viva. En esta técnica, secciones de tejido que contienen isótopos radiactivos son cubiertos por una delgada capa de emulsión fotográfica, la cual es expuesta a la radiación que emana de los isótopos radiactivos del tejido. Para determinar los lugares donde las proteínas a segregar son sintetizadas, Palade y Jamieson incubaron placas de tejido pancreático en una solución que contenía isótopos radioactivos por un breve periodo de tiempo. Durante ese instante, los aminoácios marcados fueron tomados por las células vivas e incorporados en sus sistemas metabólicos, lo cual incluía la producción de enzimas a medida que estas iban siendo producidas por los ribosomas.

A intervalos los tejidos fueron fijados, es decir matar las células en momentos variantes para poder tener una imagen estática que lo que sucede a lo largo de una secuencia de tiempo. Usando esta técnica encontraron que el retículo endoplasmático rugoso era el principal lugar de síntesis de los péptidos iniciales en la cadena de producción de las enzimas activas. Para determinar la ruta intracelular los investigadores debían encontrar una forma de eliminar el esceso de aminoácidos marcados, para esto realizaron una segunda incubación con aminoácidos no marcados, de forma tal que el retículo endoplasmático se liberara de los aminoácidos marcados y solo pudiera verse las zonas en las cuales eran transferidos los péptidos después de un tiempo.

Usando esta técnica fue posible identificar la compleja ruta de las sustancias a través del sistema de membranas internas. En resumen hay dos grandes zonas de membranas, los retículos cercanos al núcleo donde se sintetizan los péptidos, el aparato de Golgi a medio camino donde se modifican y maduran los péptidos a las proteínas funcionales o formas semiactivas, y las vesículas que transportan las sustancias entre las membranas internas y la membrana externa.

Referencias: (Black & Black, 2012; Karp, 2010, 2013; Sadava et al., 2014, 2008; Solomon et al., 2008; Tortora et al., 2010)

7.3 Proteína verde fluorescente

Técnicas empleando isotopos radioactivos han sido abandonadas paulatinamente por los biólogos. Una técnica alternativa requiere crear mutantes transgénicos empleando la inserción de un gen de medusa denominado gen de la proteína verde fluorescente. Esta proteína o por lo menos su dominio activo emite un color verde fluorescente que permite rastrear dicho dominio a medida que se mueve por la célula. 

Si se inserta el dominio de gen de la proteína verde fluorescente en otra proteína, se genera una proteína quimérica que además de sus dominios nativos posee el dominio de la proteína verde fluorescente, esta proteína quimérica puede ser seguida de forma dinámica a través del microscopio de fluorescencia para determinar la ruta de proteínas especificas al interior de la célula.

Para insertar el gen de la proteína verde fluorescente es necesario emplear retrovirus que inserten el gen en una posición específica, uno de estos es el virus de la estomatitis vesicular. Los virus como este son útiles ya que no solo insertan el gen deseado, sino que también estimulan a que la célula produzca activamente el gen deseado convirtiéndolas en fabricas muy eficientes del producto de interés.

Referencias: (Black & Black, 2012; Karp, 2010, 2013; Sadava et al., 2014, 2008; Solomon et al., 2008; Tortora et al., 2010)

7.4 Microscopia electrónica de fracciones subcelulares

Aunque las técnicas anteriores permiten seguir la ruta biosintética, estas no permiten  determinar la composición molecular del sistema de membranas internas. En las décadas de 1950 y 1960 Albert Claude y Christian De Duve (Imagen) propusieron un nuevo método que consistía en el rompimiento de la célula por homogenización. Cuando una célula se rompe por homogenización las membranas internas y externa se fragmentan, los fragmentos se fusionan rápidamente entre sí para formar vesículas de menos de 100 nm de diámetro. Las vesículas derivadas de diferentes organelos poseen propiedades diferentes, lo cual permite separarlas y estudiarlas independientemente, lo cual le da el nombre a la técnica, fracciones subcelulares.

Con el paso del tiempo las técnicas para hacerlo se han mejorado, pero el principio es el mismo, separar las membranas de diversos organelos y luego purificar las proteínas que les otorgan sus propiedades específicas. Cientos de proteínas pueden ser identificadas simultáneamente, proveyendo información de la composición molecular de cualquier organelo. Un ejemplo de los resultados que otorga esta técnica es que un simple fagosoma, que es una vesícula de menor tamaño puede contener más de 160 tipos de proteínas, muchas de las cuales ni siquiera se conocían antes o se sospechara siquiera que estuvieran involucradas en la fagocitosis.

Referencias: (Black & Black, 2012; Karp, 2010, 2013; Sadava et al., 2014, 2008; Solomon et al., 2008; Tortora et al., 2010)

7.5 Sistemas celulares libres

El fraccionamiento celular sirve para la anatomía, pero también para la fisiología, ver de que son capaces las vesículas fraccionadas representa un sistema celular libre. Cuando se realizaron los procesos, los investigadores se dieron cuenta de que los sistemas subcelulares aislados aun eran capaces de realizar actividades muy complejas, que no pueden ser estudiadas con una sola enzima aislada. Durante la década de 1960 George Palade, Philip Siekevitz,y sus colegas de la Universidad de Rockefeller emplearon esta tecnología para estudiar fracciones del retículo endoplasmático, obteniendo resultados como (1) la identificación de la función de los ribosomas tanto de forma aislada –síntesis de proteínas liberadas al citosol –como al interior de la vesícula, donde las proteínas eran almacenadas en el lumen de la vesícula. Durante las décadas pasadas, la técnica de sistemas celulares libres  ha ayudado a determinar la función de muchas proteínas involucradas en el tráfico de sustancias entre las membranas por medio de vesículas.

Referencias: (Black & Black, 2012; Karp, 2010, 2013; Sadava et al., 2014, 2008; Solomon et al., 2008; Tortora et al., 2010)

7.6 Mutantes

El estudio de mutantes es un clásico en genética molecular, y se basa en crear mutantes para genes de proteínas que se conocen estructuralmente, pero cuya función en el todo no es clara. Un mutante en este contexto es un organismo que genera una proteína que no pliega adecuadamente para realizar su función, por lo que al observar el sistema, el mutante revela cual es la función que tenía al mostrar la carencia de dicha función.

Referencias: (Black & Black, 2012; Karp, 2010, 2013; Sadava et al., 2014, 2008; Solomon et al., 2008; Tortora et al., 2010)

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